跨越物種的相遇之路，這些“鋪路人”值得被銘記 | 微生物“智”造

作者：李輝（中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所 微生物制造工程中心）

策劃：李輝 呂雪峰

文章來源于科學(xué)大院公眾號(hào)（ID ：kexuedayuan）

——

在生命科學(xué)還未曾興起的時(shí)代，人類對(duì)跨物種生命體的想象只停留在麒麟、美人魚這類形象。如今，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，物種間界限的突破不再是天方夜譚，組合物種的功能也不再是遙不可及的事情。

經(jīng)過改造，微生物能擁有來源于動(dòng)物、植物等生命體的能力（圖片來源：Wikipedia及Veer圖庫(kù)）

想要將一個(gè)物種的功能在另一個(gè)物種中完美呈現(xiàn)，把來源于不同物種，代表不同功能的DNA組裝起來是實(shí)現(xiàn)最終目標(biāo)的第一步。實(shí)現(xiàn)這個(gè)過程的技術(shù)叫做“DNA組裝”的技術(shù)，它從無到有，從繁至簡(jiǎn)的過程離不開一群才華卓越的科學(xué)家和生物工程師。

歷經(jīng)半個(gè)多世紀(jì)，“DNA組裝”的玩法趨于豐富。從場(chǎng)所來分，“DNA組裝”可以分成體內(nèi)和體外兩種，我們首先來了解下體外組裝技術(shù)創(chuàng)造者背后的故事。

游戲和玩法的締造者

在第一種DNA組裝技術(shù)誕生之前，如果說生命體是大自然天衣無縫的作品，那么第一種DNA組裝技術(shù)的誕生便賦予了生物工程師“上帝視角”和部分“造物”能力——“上帝視角”讓生命體的生物學(xué)功能在工程師眼中變成可供組裝的模塊，“造物”能力則賦予工程師組裝模塊的能力。由此，生命體的表型形式也隨著人類的想象力打開了新的圖景。

1973年，物種間邊界第一次被打破。在這一被視為遺傳工程的開山之作中，斯坦福大學(xué)的斯坦利·諾曼·科恩（Stanley Norman Cohen）教授和加州大學(xué)舊金山分校的赫伯特·韋恩·博耶（Herbert Wayne Boyer）教授是最關(guān)鍵的兩位生物工程師。他們的石破天驚之舉，是首次在體外將一個(gè)生命體的DNA片段和一個(gè)質(zhì)粒連接起來，在形成重組質(zhì)粒之后，將其轉(zhuǎn)到另一個(gè)生命體。此時(shí)，原生命體DNA所代表的生物學(xué)功能得到完美的復(fù)制。

斯坦利·諾曼·科恩和赫伯特·韋恩·博耶（圖片來源：維基百科）

這種在現(xiàn)在看來可能平平無奇的DNA組裝技術(shù)就是酶切連接，在技術(shù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的主要是限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶。（是不是喚醒你沉睡的高中記憶？）限制性內(nèi)切酶就像剪刀，能識(shí)別并切割特定DNA序列，且在切割不同來源DNA后，其留下來的缺口一致。這樣，不同切割產(chǎn)物上形成的切口就可以通過堿基互補(bǔ)配對(duì)跟彼此粘連在一起。

那DNA連接酶能發(fā)揮什么作用呢？DNA連接酶如同膠水一般，可以將兩個(gè)片段間的缺口連起來，形成完整的DNA雙鏈。雖然DNA識(shí)別位點(diǎn)的特異性對(duì)這種技術(shù)造成了限制，但截止目前，超過800種已經(jīng)商業(yè)化的限制性內(nèi)切酶還是極大增加了工程師的選擇。

酶切連接（圖片來源：Khan Academy）

尊重創(chuàng)造的制度及文化氛圍從不虧待那些聰明絕頂?shù)南敕?，與革命性技術(shù)相匹配的應(yīng)當(dāng)是締造者的名利雙收。因?yàn)檫@項(xiàng)技術(shù)的發(fā)明，兩位發(fā)明人以及他們所屬的機(jī)構(gòu)獲得了豐厚的回報(bào)，在申請(qǐng)3項(xiàng)專利之后，曾有超過470家公司有償使用過它們，專利本身也影響了數(shù)千種產(chǎn)品的開發(fā)。功不唐捐，兩人共同分享了包括“拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究獎(jiǎng)”、“國(guó)家技術(shù)獎(jiǎng)?wù)隆薄ⅰ吧垡莘颡?jiǎng)”等眾多分量十足的獎(jiǎng)項(xiàng)。

宏大的目標(biāo)催生出卓越的技術(shù)

在生物技術(shù)的圖譜中，有些技術(shù)的誕生是水到渠成。當(dāng)基礎(chǔ)研究的成果積累到一定程度時(shí)，一個(gè)神來之筆便會(huì)促進(jìn)新技術(shù)的蓬勃發(fā)展，2020年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的CRISPR基因編輯便屬于此類。但還有一些技術(shù)的發(fā)明，是由宏大的目標(biāo)所催生的。

人工合成細(xì)胞是21世紀(jì)之初的一個(gè)宏愿，這個(gè)項(xiàng)目的共同領(lǐng)導(dǎo)人是漢密爾頓·史密斯（Hamilton O Smith），克萊德·哈奇森（Clyde A Hutchison III）和克雷格·文特（J Craig Venter）教授。人工合成一個(gè)583kb（kb即kilobase，千堿基對(duì)）的支原體基因組則是他們所面對(duì)的一個(gè)具體的挑戰(zhàn)，這個(gè)挑戰(zhàn)最終催生的技術(shù)叫做吉布森組裝（也叫Gibson組裝，Gibson是這個(gè)技術(shù)主要發(fā)明人Daniel G Gibson的姓）。

丹尼爾·吉布森，克雷格·文特，克萊德·哈奇森，漢密爾頓·史密斯（圖片來源：The J. Craig Venter Institute）

在常規(guī)的酶切連接中，不同片段之間的連接依賴的是片段之間一致的酶切位點(diǎn)，這對(duì)于目標(biāo)長(zhǎng)度較小、應(yīng)用較為簡(jiǎn)單的DNA組裝任務(wù)基本夠用。但是，在面對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物較長(zhǎng)，較為復(fù)雜的DNA組裝任務(wù)時(shí)，限制性內(nèi)切酶的有限性及酶切位點(diǎn)的特異性使得這種方法顯得無能為力。

Gibson組裝擺脫了酶切連接的限制，基本能做到“包打天下”——任意兩個(gè)DNA片段，只要末端有一定長(zhǎng)度重疊的序列，兩個(gè)片段就可以被組裝起來。此外，其能組裝起來的DNA也遠(yuǎn)大于酶切連接組裝起來的DNA序列。

在Gibson組裝中，出力的主要是三種酶：T5核酸外切酶、高保真DNA聚合酶與Taq連接酶。首先是T5核酸外切酶，它能從DNA的5’到3’端逐個(gè)切除堿基，使DNA的末端變成單鏈。由于兩個(gè)需要組裝的DNA片段之間有重疊，所以兩個(gè)末端的單鏈又能通過堿基互補(bǔ)配對(duì)連接起來。此時(shí)的連接產(chǎn)物仍不完整，缺乏的堿基會(huì)由高保真的DNA聚合酶補(bǔ)上，兩個(gè)片段之間最后的間隔則由連接酶來連接。

經(jīng)由這一過程，他們最初開發(fā)這個(gè)技術(shù)的目標(biāo)得到實(shí)現(xiàn)，甚至900kb左右乃至更高千堿基對(duì)的DNA片段也可以用這種技術(shù)組裝起來。

Gibson組裝（圖片來源：翻譯自Daniel G Gibson et al., 2009）注：紅色和綠色代表不同的DNA片段，黑色代表兩個(gè)片段間一致的序列

鑒于Gibson 組裝的高效、普適，以及其在大片段DNA組裝能力方面的一騎絕塵，被開發(fā)出來之后，它很快地受到了科學(xué)界和工業(yè)界的廣泛關(guān)注和認(rèn)可。一個(gè)典型的表現(xiàn)是，2009年開發(fā)此技術(shù)的文章目前已經(jīng)被學(xué)術(shù)界的同行引用超過6000次。另外，基于Gibson 組裝的試劑盒以及可以自動(dòng)組裝DNA的儀器都已被制造出來，成為一種商品，Gibson組裝也成為目前主流的DNA組裝方法之一。其得到普及的一大重要原因是，改進(jìn)后的Gibson組裝技術(shù)，還能幫著省錢。

拯救你的“囊中羞澀”

盡管從能實(shí)現(xiàn)的組裝任務(wù)上來看，Gibson組裝基本上可以算得上一種終極的解決方案了。但是從部分使用者的角度出發(fā)，這一技術(shù)卻有一個(gè)不好意思說的缺點(diǎn)——價(jià)格太貴。購(gòu)買商業(yè)化的試劑盒，進(jìn)行一次DNA組裝，平均下來就要100來塊錢。用的次數(shù)少還好，如果需要組裝的DNA過多，那么對(duì)于一些經(jīng)費(fèi)捉襟見肘的實(shí)驗(yàn)室而言，便是不可忽視的壓力。

Gibson使用了3個(gè)酶，為了給同行省錢，也為了在DNA組裝的市場(chǎng)里分一杯羹，不少生物工程師在減少酶的種類上花了不少心思。比如，一些只使用一個(gè)酶的DNA組裝技術(shù)已經(jīng)被開發(fā)出來了。其中最便宜的一種是由中國(guó)學(xué)者所開發(fā)的，這種方法叫做T5核酸外切酶依賴的組裝（TEDA:The T5 exonuclease-dependent assembly）。顧名思義，在這種“玩法”中，扮演最為關(guān)鍵角色的酶是T5核酸外切酶。

T5核酸外切酶依賴的組裝（Yongzhen Xia et al., 2018）

TEDA組裝同樣需要被組裝的DNA片段末端存在15bp（bp即base pair，堿基對(duì)）以上的重疊區(qū)域，步驟總共分為三步。前兩步和Gibson組裝一致，都是通過T5核酸外切酶的切割以及片段間的自配對(duì)形成一個(gè)不完整的中間體。

區(qū)別在于第三步，在這個(gè)方法中，中間體直接被轉(zhuǎn)到大腸桿菌體內(nèi)，由大腸桿菌代勞，把缺口補(bǔ)上連接好，承擔(dān)省錢的重任。

除以上三種比較有代表性的、涉及到體外的DNA組裝技術(shù)，還有兩種可以直接在微生物體內(nèi)組裝DNA的技術(shù)同樣值得說道。

死對(duì)頭的精誠(chéng)合作

第一種影響力比較大的體內(nèi)組裝技術(shù)叫做RecET重組技術(shù)，這種技術(shù)的發(fā)明和推廣和一位中國(guó)學(xué)者有著非常密切的關(guān)聯(lián)，現(xiàn)山東大學(xué)的張友明教授和他曾經(jīng)的博士后合作導(dǎo)師弗朗西斯·斯圖爾特（A. Francis Stewart）是該技術(shù)主要的共同發(fā)明人。

張友明和弗朗西斯·斯圖爾特（China daily 和Francis Stewart group）

這也是一種原理看起來極致簡(jiǎn)潔的DNA組裝技術(shù)，其主要基于大腸桿菌E.coil進(jìn)行開發(fā)的。它的特點(diǎn)是能利用一個(gè)線性化的載體捕獲幾乎任何類型的DNA，不管捕獲的對(duì)象是DNA片段、質(zhì)粒還是E.coil的基因組，只要線性化的載體兩端和要捕獲DNA兩端有一致的序列，把它們一起轉(zhuǎn)到E.coil中，它們基本就可以被組裝起來。

RecET重組示意圖（圖片來源：Youming Zhang et al., 2000）

當(dāng)然，這種E.coil不是一般的E.coil。它的特殊之處在于，它是從“死對(duì)頭”噬菌體借用了三個(gè)關(guān)鍵的蛋白：最初來自噬菌體的RecE(5’-3’核酸外切酶)、RecT(單鏈DNA結(jié)合蛋白)還有Redγ(一個(gè)抑制線性DNA片段被降解的蛋白)。

實(shí)際上，將病毒來源基因或者酶應(yīng)用到生物技術(shù)的開發(fā)上，RecET重組并不是孤例，生物學(xué)家的工具包里還有很多工具同樣都是病毒的饋贈(zèng)。（而這些故事，我們則留至后續(xù)的文章中再細(xì)細(xì)道來）

所有重要的生物技術(shù)，都具有巨大的商業(yè)價(jià)值。RecET重組技術(shù)的歷程再次證明了這一點(diǎn)。在該技術(shù)誕生兩年之后，為拓寬該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用，作為發(fā)明人之一的張友明教授便作為首席科技官創(chuàng)建了一個(gè)生物技術(shù)公司。再之后，他和他曾經(jīng)的博士后合作導(dǎo)師雙雙當(dāng)選為歐洲科學(xué)院院士。

在組裝DNA方面，酵母菌出道即巔峰

有一句俗語叫“林子大了什么鳥都有”，對(duì)于種類龐大的微生物世界而言，這句話更是貼切。在組裝DNA這個(gè)方面，有些微生物本身的能力十分出眾，堪稱“出道即巔峰”，例如目前同源重組能力最為出色的酵母菌。

在酵母菌中進(jìn)行DNA組裝的要求很簡(jiǎn)單：只要兩段DNA之間有一定重疊的部分，酵母菌就可以利用它的能力將這兩個(gè)片段給連起來。2008年的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)可算是對(duì)其同源重組能力最好的例證。

這項(xiàng)工作還是曾經(jīng)人工合成支原體基因組的團(tuán)隊(duì)所做的，令人矚目的是，他們將25個(gè)兩兩重疊、大小在17-35kb之間的DNA片段全部轉(zhuǎn)到酵母中，而酵母能一次性將這些片段連接成完整的基因組。

在酵母中組裝支原體的基因組（Gibson D G et al., 2008）

經(jīng)過了幾十年的發(fā)展，目前生物工程師們已經(jīng)具有了很強(qiáng)的將不同來源DNA組裝起來的能力。除解決實(shí)際問題之外，新技術(shù)的開發(fā)和迭代還能加速人類想象力邊界的拓寬。

那么，不妨也發(fā)揮一下你的想象：假如你現(xiàn)在擁有了組裝不同物種來源DNA的能力，對(duì)于跨越物種邊界的生命體，你有什么樣的奇思妙想和憂心之處？不妨在評(píng)論區(qū)告訴我們，我們會(huì)給你想法的可行性把把脈，解答你的疑惑和擔(dān)心。

參考文獻(xiàn)：

[1] Cohen S N, Chang A C Y, Boyer H W, et al. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1973, 70(11): 3240-3244.

[2] 克雷格 文特爾，生命的未來，浙江人民出版社，2016

[3] Gibson D G, Benders G A, Andrews-Pfannkoch C, et al. Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a Mycoplasma genitalium genome[J]. science, 2008, 319(5867): 1215-1220.

[4] Gibson D G, Young L, Chuang R Y, et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases[J]. Nature methods, 2009, 6(5): 343-345.

[5] Xia Y, Li K, Li J, et al. T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis[J]. Nucleic acids research, 2019, 47(3): e15-e15.

[6] Zhang Y, Buchholz F, Muyrers J P P, et al. A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli[J]. Nature genetics, 1998, 20(2): 123-128.

[7] Zhang Y, Muyrers J P P, Testa G, et al. DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli[J]. Nature biotechnology, 2000, 18(12): 1314-1317.

[8] Gibson D G, Benders G A, Axelrod K C, et al. One-step assembly in yeast of 25 overlapping DNA fragments to form a complete synthetic Mycoplasma genitalium genome[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2008, 105(51): 20404-20409.