顯微技術(shù)的發(fā)展歷史及激光共聚焦顯微鏡淺析

顯微鏡是人類最偉大的發(fā)明之一。從遠(yuǎn)古時(shí)代，人們就渴望看到更多肉眼看不到的事物。

2000多年以前就有人曾經(jīng)用玻璃來折射光的角度。公元前2世紀(jì)，克勞迪思·托勒密發(fā)現(xiàn)一根木棍放在水里會(huì)變彎，并且非常精確地判斷它的“彎曲”角度。然后，他又計(jì)算出了光在水中的折射常數(shù)。 公元1世紀(jì)，人們發(fā)明了玻璃，羅馬人透過它觀察事物和做各種測(cè)試。他們用各種形狀的透明玻璃來做實(shí)驗(yàn)，其中就有邊緣薄、中間厚的玻璃。他們發(fā)現(xiàn)，如果你把“鏡片”放在物體上，物體會(huì)看起來變大了，這些所謂的鏡片其實(shí)并不是現(xiàn)代意義上的鏡片，應(yīng)該叫放大鏡，或者凸透鏡。與此同時(shí)，塞內(nèi)卡認(rèn)為是水珠的圓球狀特性造成了放大效果，“不清楚或微小的字在裝滿水的圓玻璃球下，可以被放大、變得清楚”。 直到13世紀(jì)，鏡片才開始被廣泛使用，那時(shí)的眼鏡商通過磨玻璃的形式來制造鏡片。

16世紀(jì)末期，荷蘭出現(xiàn)了通過疊加鏡片的形式制造的光學(xué)設(shè)備，即最早的顯微鏡，發(fā)明者是荷蘭眼鏡商亞斯·詹森，或者一位荷蘭科學(xué)家漢斯·利珀希，他們用兩片透鏡制作了簡(jiǎn)易的顯微鏡，但并沒有用這些儀器做過重要的觀察。 后來有兩個(gè)人開始在科學(xué)上使用顯微鏡。第一個(gè)是意大利科學(xué)家伽利略，他通過顯微鏡觀察到一種昆蟲后，第一次對(duì)它的復(fù)眼進(jìn)行了描述；第二個(gè)是荷蘭亞麻織品商人列文虎克(1632年-1723年)，他自己學(xué)會(huì)了磨制透鏡，第一次描述了許多肉眼所看不見的微小植物和動(dòng)物。

1931年，德國科學(xué)家恩斯特·魯斯卡通過研制電子顯微鏡，使生物學(xué)發(fā)生了一場(chǎng)革命。這使得科學(xué)家能觀察到百萬分之一毫米那樣小的物體。1986年，恩斯特·魯斯卡被授予諾貝爾獎(jiǎng)。 在顯微鏡被發(fā)明之前，人類關(guān)于周圍世界的觀念局限在用肉眼，或者靠手持透鏡幫助肉眼所看到的東西。顯微鏡把一個(gè)全新的世界展現(xiàn)在人類的視野里，人們第一次看到了數(shù)以百計(jì)的"新的"微小動(dòng)物和植物，以及從人體到植物纖維等各種東西的內(nèi)部構(gòu)造。

顯微鏡的分類

顯微鏡的種類有很多，常見的有：光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡、探針顯微鏡等。

光學(xué)顯微鏡又有多種分類方法： 按使用目鏡的數(shù)目可分為雙目和單目顯微鏡； 按圖像是否有立體感可分為立體顯微鏡和非立體視覺顯微鏡； 按觀察對(duì)像可分為生物和金相顯微鏡等； 按光學(xué)原理可分為偏光、相襯和微差干涉對(duì)比顯微鏡等； 按光源類型可分為普通光、熒光、紅外光和激光顯微鏡等； 按接收器類型可分為目視、攝影和視頻顯微鏡等。 電子顯微鏡又可分為掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡等。

探針顯微鏡，產(chǎn)品又包括掃描隧道顯微鏡、原子力顯微鏡、橫向力顯微鏡等。

激光共聚焦顯微鏡

激光共聚焦掃描顯微鏡(Confocal laser scanning microscope，CLSM)脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場(chǎng)光源和局部平面成像模式，采用激光束作掃描光源，激光束經(jīng)照明針孔，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對(duì)標(biāo)本焦平面逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像。

掃描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)，通過控制調(diào)焦深度，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi)，通過計(jì)算機(jī)分析和模擬，就能顯示所觀察表面的立體結(jié)構(gòu)。 激光共焦光學(xué)系統(tǒng)僅接收通過圓形針孔聚焦的光線，并非采集從樣品上反射和散射的所有光線。這樣有助于消除模糊，且由于點(diǎn)對(duì)點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響，讓其能夠獲得比普通顯微鏡對(duì)比度更高的圖像。

在結(jié)構(gòu)配置上，激光掃描共聚焦顯微鏡除了包括普通光學(xué)顯微鏡的基本構(gòu)造外，還包括激光光源、掃描裝置、檢測(cè)器、計(jì)算機(jī)系統(tǒng) (包括數(shù)據(jù)采集、處理、轉(zhuǎn)換、應(yīng)用軟件)、圖像輸出設(shè)備、光學(xué)裝置和共聚焦系統(tǒng)等部分。由于該儀器具有高分辨率、高靈敏度、"光學(xué)切片"(Optical sectioning)、三維重建、動(dòng)態(tài)分析等優(yōu)點(diǎn)，因而為表面分析及生物醫(yī)學(xué)等研究提供了有效手段。