生殖干細(xì)胞：構(gòu)建基因編輯家畜的“利器”

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)干細(xì)胞研究與轉(zhuǎn)化中心主任 鄒康

工程化育種技術(shù)是利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)建立的新型育種技術(shù),即通過干細(xì)胞體外培養(yǎng)、基因編輯、體外誘導(dǎo)分化、克隆等技術(shù)來實(shí)現(xiàn)優(yōu)良性狀相關(guān)基因的篩查和品種選育。這不僅能顯著加快育種速度、縮短培育周期,提升優(yōu)良品種的選育效率,而且能夠有效提高動(dòng)物產(chǎn)量和育種質(zhì)量。因此,不論是在應(yīng)對自然環(huán)境變化或國際局勢突變等情況造成的地方優(yōu)良品種或?yàn)l危種畜的危機(jī)等重大戰(zhàn)略方向上,還是在減少激素和抗生素的使用,改善家畜肉質(zhì)健康等關(guān)乎民計(jì)民生的問題上,都具有重要的戰(zhàn)略意義。

基因編輯技術(shù)與克隆技術(shù)結(jié)合,可以用于構(gòu)建含有編輯過的基因的動(dòng)物(簡稱基因編輯動(dòng)物),為工程化育種提供基礎(chǔ)。目前常用的構(gòu)建基因編輯動(dòng)物的技術(shù)有以下4種技術(shù),分別是:

1. 體細(xì)胞核移植技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)最著名的成果就是多莉羊的克隆,即用供體的體細(xì)胞細(xì)胞核與卵母細(xì)胞的胞質(zhì)融合并在體外發(fā)育,然后通過胚胎移植技術(shù)植入代孕受體子宮,發(fā)育得到的子代個(gè)體。由于體細(xì)胞基因組的表觀修飾等原因?qū)е露嗬蜓虻膲勖芏?這也限制了這項(xiàng)技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用。

2. 原核注射法。該方法通過將構(gòu)建好的載體DNA注射到受精卵的原核(一般是雄性原核)中,或?qū)gRNA,模板DNA和Cas9蛋白的組合注射到受精卵中,實(shí)現(xiàn)基因編輯,再將注射完成后的胚胎在體外培養(yǎng)到適合的階段,然后移植到假孕受體的子宮中,發(fā)育成帶有新性狀的子代。

3. 基因打靶技術(shù),即將經(jīng)過基因編輯的胚胎干細(xì)胞(ESCs)或誘導(dǎo)性多能性干細(xì)胞( iPSCs)這類多能性干細(xì)胞植入發(fā)育的囊胚中,再通過胚胎移植技術(shù)植入受體的子宮,發(fā)育得到一個(gè)源自于多能性干細(xì)胞的后代。雖然這個(gè)技術(shù)在小鼠這類模式動(dòng)物上很成熟,但在家畜克隆上仍存在一些技術(shù)難題。最大的障礙就是目前建立的家畜多能性干細(xì)胞系的功能還不夠完善,特別是生殖嵌合能力偏弱,把編輯的遺傳性狀傳遞給后代的效率較低。而用iPSCs誘導(dǎo)技術(shù),可能會(huì)由于過表達(dá)原癌基因造成一定的風(fēng)險(xiǎn)性,以及表觀修飾的問題也會(huì)對后代的健康造成潛在的影響。

4. 生殖干細(xì)胞移植技術(shù),即從優(yōu)良性狀的個(gè)體分離生殖干細(xì)胞(包括精原干細(xì)胞或卵原干細(xì)胞),在體外培養(yǎng),通過基因編輯技術(shù)對生殖干細(xì)胞的基因組進(jìn)行修飾以獲得新的性狀,然后有三個(gè)途徑獲得基因編輯后代:一是將這些干細(xì)胞移植到受體的性腺中,那么這些干細(xì)胞就可以在受體的睪丸或者卵巢中源源不斷的產(chǎn)生含有這些優(yōu)良性狀基因的配子,進(jìn)而通過自然交配或者人工授精的技術(shù),得到大量子代;二是通過生殖干細(xì)胞的一個(gè)特性,即在體外培養(yǎng)的過程中會(huì)自發(fā)轉(zhuǎn)化成類似于胚胎干細(xì)胞的多能性狀態(tài),從而可以代替家畜的胚胎干細(xì)胞或iPSCs進(jìn)行基因打靶;三是利用類器官技術(shù)將生殖干細(xì)胞體外誘導(dǎo)成為有功能的配子,再通過人工授精獲得子代。

相比于前三種技術(shù),利用生殖干細(xì)胞構(gòu)建基因編輯動(dòng)物的方法屬于較新的思路。雖然精原和卵原干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和移植技術(shù)已經(jīng)分別在上世紀(jì)九十年代和2009年建立,但這些技術(shù)僅在嚙齒類動(dòng)物上取得了成功。由于科學(xué)技術(shù)發(fā)展的限制,大動(dòng)物生殖干細(xì)胞的研究一直相對滯后。直到近幾年,豬、羊等家畜的生殖干細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)陸續(xù)被攻克,這意味著利用生殖干細(xì)胞構(gòu)建基因編輯的家畜的時(shí)代即將到來。

生殖干細(xì)胞在工程化育種上有獨(dú)特的優(yōu)勢,即最直接的生殖力傳遞:生殖干細(xì)胞的功能是分化成配子(精子或卵子),因此將基因編輯過的生殖干細(xì)胞植入受體后,可以源源不斷的產(chǎn)生含有優(yōu)良性狀基因的配子,并高效的得到后代。相比之下,大動(dòng)物的多能性干細(xì)胞,比如胚胎干細(xì)胞或者iPSCs,其生殖力嵌合的能力低于小鼠的多能性干細(xì)胞,導(dǎo)致獲得基因編輯子代的效率要低于生殖干細(xì)胞。

值得注意的是,近幾年隨著類器官技術(shù)的迅猛發(fā)展,利用生殖干細(xì)胞建立睪丸或者卵巢類器官這一新思路為家畜工程化育種帶來了新的方向。類器官是讓干細(xì)胞在培養(yǎng)皿中形成一個(gè)類似于器官且有生物功能的組織結(jié)構(gòu),比如利用小鼠和人類的干細(xì)胞已經(jīng)能夠較好的建立大腦、肝臟、腎臟、皮膚、睪丸、卵巢等組織的類器官,并具備了部分的生物學(xué)功能。因此,如果能夠建立有功能的家畜睪丸類器官或卵巢類器官,則可以直接在培養(yǎng)皿里形成精子或卵子,進(jìn)一步提升了生產(chǎn)效率,節(jié)省了時(shí)間空間,也可以將優(yōu)良品種的干細(xì)胞作為重要的品種資源進(jìn)行戰(zhàn)略儲(chǔ)備。

然而到目前為止,雖然生殖干細(xì)胞技術(shù)在小鼠等模式動(dòng)物上取得了巨大的成功,但家畜生殖干細(xì)胞技術(shù)仍處于發(fā)展的起步階段,家畜生殖干細(xì)胞的體外穩(wěn)定培養(yǎng)、定向分化、類器官建立等技術(shù)都遇到了技術(shù)瓶頸,屬于國際競爭的熱點(diǎn)。國內(nèi)外科研團(tuán)隊(duì)目前針對家畜生殖干細(xì)胞的重編程、類器官構(gòu)建和體外誘導(dǎo)分化等核心技術(shù),都投入了大量的人力物力,希望早日有所突破。

實(shí)際上,導(dǎo)致這些技術(shù)發(fā)展受限的瓶頸是調(diào)控大動(dòng)物生殖干細(xì)胞的自我更新和分化機(jī)制的研究仍不清晰,這也限制著家畜生殖干細(xì)胞在畜牧學(xué)上的應(yīng)用。因此,聚焦大動(dòng)物生殖干細(xì)胞的生物學(xué)特征,探究生殖系統(tǒng)內(nèi)調(diào)控其增殖分化的信號(hào)通路,將會(huì)極大的推進(jìn)生殖干細(xì)胞在動(dòng)物工程化育種方向的應(yīng)用,進(jìn)一步提升我國畜牧業(yè)的競爭力。與此同時(shí),應(yīng)進(jìn)一步完善基因工程技術(shù)在畜牧學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的法規(guī)政策,建立規(guī)范安全的應(yīng)用準(zhǔn)則,從而更高效安全的推進(jìn)我國的畜牧業(yè)發(fā)展。

作者簡介

鄒康,南京農(nóng)業(yè)大學(xué)干細(xì)胞研究與轉(zhuǎn)化中心主任,南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院教授、博士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)樯掣杉?xì)胞與微環(huán)境的相互作用機(jī)制及生殖干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化應(yīng)用。在Nature Cell Biology等期刊發(fā)表論文三十余篇,被引用超過1200次,工作被Nature,Science等雜志專版評論,獲得了國家自然科學(xué)二等獎(jiǎng)(第二獲獎(jiǎng)人),江蘇特聘教授等獎(jiǎng)勵(lì)和榮譽(yù),擔(dān)任Zoological Research期刊編委。