青蒿素

研究歷程

瘧疾是人類最古老的疾病之一，至今依然還是一個全球廣泛關(guān)注且亟待解決的重要公共衛(wèi)生問題。

早在 1631 年，意大利傳教士薩魯布里諾（Agostino Salumbrino）從南美洲秘魯人那里獲得了一種有效治療熱病的藥物——金雞納樹皮（cinchona bark）并將之帶回歐洲用于熱病治療，不久人們發(fā)現(xiàn)該藥對間歇熱具有明顯的緩解作用。1820 年法國化學(xué)家佩爾蒂埃（Pierre Joseph）和藥學(xué)家卡文托（Joseph Bienaimé Caventou）從金雞納樹皮分離治療瘧疾的有效成分并將之命名為奎寧（quinine）。

1944 年美國有機化學(xué)家伍德沃德（Robert Woodward）與德林（William Doering）第一次成功地人工合成奎寧。此后，科學(xué)家們對抗瘧藥不斷改進，形成了以奎寧等為代表的芳、雜環(huán)甲醇類，以氯喹等為代表的 4 -氨基喹啉類，以及以阿莫地喹等為代表的雜環(huán)氨酚類抗瘧藥。這些抗瘧藥在人類防治瘧疾方面起到了重要作用。

20世紀60年代初，惡性瘧原蟲在一些區(qū)域已經(jīng)出現(xiàn)對氯喹的抗藥性，尤以東南亞最為嚴重。當時，隨著越南戰(zhàn)爭的逐步升級，抗氯喹惡性瘧的侵襲困擾交戰(zhàn)雙方，導(dǎo)致作戰(zhàn)部隊大量減員。為此，美國投入大量的人力、物力來研究瘧疾，主要目標是尋找新型的抗瘧藥物。其中，美國華爾特·里德陸軍研究所（Walter Reed Army Institute of Research）從20世紀60年代末開始篩選了20多萬種化合物。越南方面受條件所限，無力研制開發(fā)新藥，于是請求中國幫助解決瘧疾防治問題。9

1967年5月23日，國家科委、中國人民解放軍總后勤部在北京聯(lián)合召開會議。會議決定，爭取在較短時間內(nèi)重點解決抗藥性瘧疾的防治藥物、抗藥性瘧疾的長效預(yù)防藥和驅(qū)避劑三個方面的問題。設(shè)立代號為523項目的抗瘧藥物研究工作。在接下來14年中，來自60所軍民機構(gòu)的500位科學(xué)家參與了此項目。9

前期探索——從傳統(tǒng)藥物中篩選目標產(chǎn)物

“523任務(wù)”制定的《中醫(yī)中藥、針灸防治瘧疾研究規(guī)劃方案》第二項為“民間防治瘧疾有效藥物和療法的重點調(diào)查研究”。該方案的備注中列出了根據(jù)文獻調(diào)查提出的作為重點研究的藥物，其中列有青蒿（排在第5位）。但是，在之后的記錄中沒有發(fā)現(xiàn)有關(guān)青蒿篩選的相關(guān)記載。9

1969年1月21日，中醫(yī)研究院（現(xiàn)中國中醫(yī)科學(xué)院）中藥研究所加入“523任務(wù)”的“中醫(yī)中藥專業(yè)組”，屠呦呦被任命為中醫(yī)研究院項目小組組長，組員是余亞綱和郎林福。

1970年，“全國523辦公室”安排軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的顧國明到北京中藥所協(xié)助他們從傳統(tǒng)中藥中尋找抗瘧藥物。余亞綱查閱中醫(yī)藥文獻，并且以1965年上海市中醫(yī)文獻館出版的《瘧疾專輯》為藍本，進行整理分析后列出重點篩選的藥物為：烏頭、烏梅、鱉甲、青蒿等。他們共用水煎或乙醇提取，篩選了近百個藥方，北京中藥所檔案顯示，從1970年2月開始，屠呦呦小組一共送了10批166種樣品到軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院進行檢測，其中第8批中最后一個藥物為雄黃，抑制率為100%；第9批中也出現(xiàn)了幾次雄黃，抑制率均在90%以上；青蒿出現(xiàn)第10批樣品中，抑制率顯示為68%，其提取溶劑為乙醇。

1971年下半年，屠呦呦領(lǐng)導(dǎo)的科研小組（包括鐘裕蓉、郎林福等）從東晉葛洪《肘后備急方之治寒熱諸瘧方》中“青蒿一握，以水二升漬，絞取汁，盡服之”的記載中受到了啟發(fā)，認為溫度高有可能對青蒿有效成分造成破壞而影響療效，便由用乙醇提取改為用沸點比乙醇低的乙醚提取。9

青蒿素的發(fā)現(xiàn)

1971年5月21日～6月1日全國瘧疾防治研究工作座談會在廣州召開，會后，北京中藥所重新組織了研究小組，屠呦呦仍任組長，與組員鐘裕蓉繼續(xù)提取中藥，郎林福和劉菊福做動物試驗。根據(jù)北京中藥所的藥物篩選記錄，1971年7月26日篩選（序號16）青蒿抑制率12%，9月1日（序號114）青蒿醇抑制率40%，10月4日（序號191）青蒿乙醚抑制率達100%。1971年1月起，屠呦呦小組開始大量提取青蒿乙醚提取物，并于當年6月底完成了狗的毒性試驗。為了能盡快開展臨床試驗，在當年對青蒿乙醚提取物對狗的毒性試驗結(jié)果尚存在一定爭議的同時，6～8月期間，屠呦呦、郎林福、岳鳳仙與章國鎮(zhèn)、嚴述常、潘恒杰、趙愛華、方文賢先后以不同劑量分作兩批進行了青蒿乙醚中性提取部分的自體試服，均未出現(xiàn)明顯的毒副作用。

1972年3月8日，屠呦呦作為北京中藥所的代表，在“全國523辦公室”主持的南京“中醫(yī)中藥專業(yè)組”會議上作題為《用毛澤東思想指導(dǎo)發(fā)掘抗瘧中草藥工作》的報告，報告了青蒿乙醚中性粗提物的鼠瘧、猴瘧抑制率達100%的結(jié)果，引起全體與會者的關(guān)注。資料顯示，復(fù)篩時屠呦呦從本草和民間的“絞汁”服用的說法中得到啟發(fā)，考慮到有效成分可能在親脂部分，于是改用乙醚提取，這樣動物效價才有了顯著提高，使青蒿的動物效價由30%～40%提高到95%以上。

1972年8月，屠呦呦帶隊在海南島開展青蒿乙醚中性提取物的臨床療效試驗。期間，倪慕云設(shè)計了色譜柱分離的前處理，使青蒿乙醚提取物中性部分的抗瘧作用再次得到提高。鐘裕蓉從文獻獲知硅膠柱分離中性化合物更有效，于是便與助手崔淑蓮在倪慕云柱前處理的基礎(chǔ)上，按文獻提供的方法用硅膠柱層析，石油醚-乙醚（后改為石油醚-乙酸乙酯）梯度洗脫，分離乙醚中性提取物。

1972年11月8日，改用上海試劑廠生產(chǎn)的硅膠柱分離，然后用石油醚和乙酸乙酯-石油醚（不同比例）多次洗脫。最先獲得少量的針狀結(jié)晶，編號為“針晶Ⅰ”（No.1或針1）；隨后洗脫出來的針狀結(jié)晶編號為“針晶Ⅱ”（No.2或針2）；再后來得到的另一種方形結(jié)晶，編號為“結(jié)晶Ⅲ”（No.3或方晶）。同年12月初，經(jīng)鼠瘧試驗證明，“針晶Ⅱ”是唯一具備抗瘧作用的有效單體。此后，北京中藥所向“全國523辦公室”匯報時，將抗瘧有效成分“針晶Ⅱ”改稱為“青蒿素Ⅱ”，有時也稱青蒿素。再后，北京中藥所均稱“青蒿素Ⅱ”為青蒿素。9

1975年6月，北京中藥所重新開展青蒿素的臨床研究，與湖北健民制藥廠合作，用四川酉陽黃花蒿、云南溶劑汽油法提取青蒿素（黃花蒿素），分別在海南或與湖北醫(yī)科院、武鋼和河南等單位合作進行的。

1977年《科學(xué)通報》第22卷第3期，首次發(fā)表了青蒿素化學(xué)結(jié)構(gòu)及相對構(gòu)型的論文，題目是《一種新型的倍半萜內(nèi)酯——青蒿素》。13青蒿素的結(jié)構(gòu)完全公諸于世。

其他抗瘧藥物的發(fā)現(xiàn)

1972年10月21日，山東省寄生蟲病研究所研究人員在用乙醚及酒精對山東產(chǎn)的黃蒿進行提取，經(jīng)動物試驗，獲得較好的效果后，向“全國523辦公室”作了書面報告并指出：黃花蒿的提取物抗鼠瘧的結(jié)果，與北京中藥所青蒿提取物的實驗報告一致。當年11月，山東省中醫(yī)藥研究所從山東省泰安地區(qū)采來的黃花蒿（ArtemisiaannuaL.）中分離提取出7種結(jié)晶，其中第5號結(jié)晶命名為“黃花蒿素”，具有抗瘧作用。1972年底，云南“523辦公室”副主任傅良書得知了北京中藥所青蒿研究的情況后，提出利用當?shù)刂参镔Y源豐富的有利條件，對菊科蒿屬植物進行普篩。

1973年，羅澤淵在云南大學(xué)校園內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種一尺多高、氣味很濃的艾屬植物——“苦蒿”，結(jié)果發(fā)現(xiàn)“苦蒿”的乙醚提取物有抗瘧效果，復(fù)篩后結(jié)果一樣后改稱為“黃蒿素”。9

1978年，蒿甲醚與青蒿琥酯分別研制成功。

1989年12月，“抗瘧新藥——青蒿琥酯”獲得國家發(fā)明三等獎。

1996年12月，中國科學(xué)院上海藥物研究所的“抗瘧新藥——蒿甲醚”發(fā)明獲得國家發(fā)明三等獎。

結(jié)構(gòu)測定

1973年初，北京中藥所開始著手對青蒿素Ⅱ進行結(jié)構(gòu)測定，但由于化學(xué)研究力量和儀器設(shè)備薄弱，結(jié)果不理想。

自1974年2月到1976年間，北京中藥所先后派出倪慕云、鐘裕蓉、樊菊芬和劉靜明到中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所（簡稱“有機所”）參與結(jié)構(gòu)測定工作。

1975年，屠呦呦與中國科學(xué)院生物物理研究所（簡稱“生物物理所”）取得聯(lián)系并開展協(xié)作，用當時國內(nèi)先進的X衍射方法測定青蒿素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在1975年底至1976年初得到了青蒿素的晶體結(jié)構(gòu)。后經(jīng)梁麗等在精細地測定反射強度數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，確立了青蒿素的絕對構(gòu)型。9

臨床驗證

1973年9月，北京中藥所研究人員帶上所里分離獲得的青蒿素Ⅱ100多克赴海南開展臨床驗證，一共做了8例臨床，其中惡性瘧5例、間日瘧3例。結(jié)果顯示，青蒿素對間日瘧有效，但是未能證明對惡性瘧的效果。

1974年5月中上旬，山東省黃花蒿協(xié)作組在山東巨野縣城關(guān)東公社朱莊大隊用黃花蒿素對10例間日瘧患者進行臨床觀察，效果很好。9月8日，云南臨床協(xié)作組的陸偉東、王學(xué)忠?guī)еS蒿素到云縣、茶坊一帶進行臨床效果觀察。并且提供藥給廣東中醫(yī)學(xué)院的李國橋率醫(yī)療隊開展的腦型瘧的救治以及“7351”的臨床驗證等工作。到當年年底，廣東醫(yī)療隊共驗證了18例，其中惡性瘧14例（包括孕婦腦型瘧1例、黃疸型瘧疾2例）、間日瘧4例。匯集之前云南協(xié)作組驗證的3例患者，云南提取的黃蒿素首次共驗證了21例病人，其中間日瘧6例、惡性瘧15例，全部有效。此次試驗明確了黃蒿素對惡性瘧疾的效果。

1975年4月，在成都召開了“523任務(wù)”中醫(yī)中藥專業(yè)座談會。由于李國橋等用黃蒿素治療惡性瘧取得了良好效果，制定了當年的研究計劃，開始進行全國范圍內(nèi)的臨床驗證。9

截至1978年11月青蒿素（包括黃花蒿素、黃蒿素）治療瘧疾科研成果鑒定會時，參與青蒿及青蒿素研究和協(xié)作的單位有45家之多。這些單位用青蒿粗制劑、青蒿素共進行了6555例的臨床驗證，用青蒿素制劑治療的有2099例，其中惡性瘧588例（含腦型瘧141例）、間日瘧1511例。

青蒿素改進

青蒿素對瘧疾具有速效、低毒的特點，但是用后其“復(fù)燃率”很高，而且只能口服，生物利用度低，且因溶解度小而難以制成注射劑液用于搶救嚴重病人。

1976年2月，“全國523辦公室”將青蒿素結(jié)構(gòu)改造的任務(wù)下達給中國科學(xué)院上海藥物研究所（簡稱“上海藥物所”）。上海藥物所發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素的效價比青蒿素高1倍。由于雙氫青蒿素的分子中存在半縮醛的結(jié)構(gòu)，性質(zhì)不夠穩(wěn)定，而且溶解度也未見改善。李英等又從雙氫青蒿素出發(fā)合成了它的醚類、羧酸酯類和碳酸酯類衍生物。顧浩明等通過動物試驗，發(fā)現(xiàn)幾十個衍生物的抗瘧活性幾乎都高于青蒿素。其中，SM224（后命名為“蒿甲醚”）的油溶性大、性質(zhì)穩(wěn)定，抗瘧活性是青蒿素的6倍9。

1977年8月，桂林制藥廠劉旭等設(shè)計合成了10多個青蒿素衍生物；其中雙氫青蒿素的琥珀酸半酯在鼠瘧篩選中抗瘧效價比青蒿素高3～7倍，可生成溶于水的鈉鹽，用于制備水溶性靜脈注射劑，是救治重癥瘧疾的速效、方便使用的劑型。

1978年7～9月，在完成藥學(xué)、藥理、藥代、藥效、毒理、制劑等實驗研究后，領(lǐng)導(dǎo)小組批準蒿甲醚在海南島進行首次臨床試驗，臨床試驗證明療效很好。

1990年，北京中藥所邀請中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所等單位討論，認為雙氫青蒿素是蒿甲醚和青蒿琥酯的體內(nèi)活性代謝產(chǎn)物，而且生產(chǎn)成本較低，可以作為開發(fā)對象。于是啟動了對雙氫青蒿素的抗瘧藥理、毒理和安全性的評價，后由廣州中醫(yī)學(xué)院進行臨床試驗，先后在海南島收治惡性瘧患者349例。其中，7天療程總劑量480毫克治療了239例，觀察28天后，發(fā)現(xiàn)治愈率達97.5%，結(jié)果表明雙氫青蒿素具有良好的抗瘧效果。9

青蒿素組方

1982年下半年，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院周義清和滕翕和向中國青蒿素及其衍生物研究指導(dǎo)委員會提出“合并用藥延緩青蒿素抗性產(chǎn)生的探索研究”立題申請，得到批準，并提供啟動經(jīng)費。鄧蓉仙、滕翕和組織自主研發(fā)的本芴醇（也是“523任務(wù)”期間的成果之一）與青蒿素組方既顯示出速效的特點，又有治愈率高的優(yōu)點。最后經(jīng)過鼠瘧、猴瘧的各種實驗之后發(fā)現(xiàn)蒿甲醚和本芴醇1:6配比適宜，并于1992年完成了全部研究工作。為了進一步提高療效，縮短療程，延緩抗藥性的產(chǎn)生，中國科學(xué)家用青蒿素及其衍生物與“523任務(wù)”期間或之后化學(xué)組研究人員研發(fā)的新化學(xué)抗瘧藥配伍，不僅發(fā)明了蒿甲醚本芴醇復(fù)方（coartem），還有雙氫青蒿素磷酸哌喹復(fù)方（artekin）、青蒿素磷酸萘酚喹復(fù)方（arco）、復(fù)方哌喹片（CV8）、青蒿素-哌喹片（artequick）等。青蒿素類抗瘧藥組成復(fù)方或聯(lián)合用藥（ACTs），已被世界衛(wèi)生組織（WHO）確定為全球治療瘧疾必須使用的唯一用藥方法。利用青蒿素類藥復(fù)方加服小劑量的伯喹治療現(xiàn)癥病人以阻止瘧疾傳播的技術(shù)，也被WHO確認和推薦。9

2016年，科學(xué)雜志《eLife》刊登，德國馬克斯普朗克分子植物生理學(xué)研究所專家發(fā)明了利用COSTREL方法從煙草中大量提取青蒿素的方法。2019年6月17日，新華社電，經(jīng)過三年多科研攻堅，屠呦呦團隊在“抗瘧機理研究”“抗藥性成因”“調(diào)整治療手段”等方面終獲新突破，提出新的治療應(yīng)對方案：一是適當延長用藥時間，由三天療法增至五天或七天療法；二是更換青蒿素聯(lián)合療法中已產(chǎn)生抗藥性的輔助藥物。國際頂級醫(yī)學(xué)期刊《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志（NEJM）》刊載了屠呦呦團隊該項重大研究成果和“青蒿素抗藥性”治療應(yīng)對方案。

物理性質(zhì)

青蒿素的分子式為C15H22O5，分子量282.34。它是一種新型倍半萜內(nèi)酯，具有過氧鍵和δ-內(nèi)酯環(huán)，有一個包括過氧化物在內(nèi)的1,2,4-三噁烷結(jié)構(gòu)單元，這在自然界中是十分罕見的，它的分子中包括有7個手性中心。它的生源關(guān)系屬于青蒿素類型，其特征是A、B環(huán)順聯(lián)，異丙基與橋頭氫呈反式關(guān)系，青蒿素中A環(huán)碳架被一個氧原子打斷。1

青蒿素為無色針狀結(jié)晶，熔點為156～157℃，[α]17D=+66.3°（c=1.64氯仿）。易溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯和苯，可溶于乙醇、乙醚，微溶于冷石油醚，幾乎不溶于水。因其具有特殊的過氧基團，它對熱不穩(wěn)定，易受濕、熱和還原性物質(zhì)的影響而分解。IR譜（KBr）具有一個六元環(huán)內(nèi)酯（1745 cm）和過氧基團（831，881，1115 cm-1）。不含雙鍵，無紫外吸收。高分辨質(zhì)譜（m/e282.1472M+）及元素分析（C63.72%，7.86%）。結(jié)晶學(xué)參數(shù)：空間群，晶胞參數(shù)a=24.098 ?，b=9.468 ?，c=6.399 ?。密度：實驗d0=1.30 g/cm3，計算d0=1.294 g/cm3，單胞中分子數(shù)Z=4。1

化學(xué)性質(zhì)

青蒿素是一種內(nèi)酯，因而可以與鹽酸羥胺發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)物遇鐵離子顯色。雖然青蒿素含有過氧鍵，但相較于其他的過氧化物，青蒿素化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定，加熱到熔點仍不分解。青蒿素可被三苯膦或碘離子定量地還原，這一反應(yīng)可用于定量分析。在常壓和鈀-碳酸鈣催化下，青蒿素的過氧鍵可被氫氣還原，生成氫化青蒿素（C15H22O4）。以硼氫化鈉處理青蒿素，則內(nèi)酯的羰基被還原，生成半縮醛還原青蒿素（C15H24O5）。131617

室溫下以碳酸鉀甲醇溶液處理青蒿素一小時，酸化后可以得到一種含有環(huán)氧基團的五元環(huán)內(nèi)酯（C15H20O4）；以硫酸-乙酸處理青蒿素可以得到另一種五元環(huán)內(nèi)酯（C14H20O3）。16

過氧基團反應(yīng)

青蒿素與三苯基磷反應(yīng)可以證明青蒿素含有一個當量的過氧基，其做法是青蒿素在三苯基磷和二甲苯溶液中通氮氣回流，再加甲醛及水攪拌，水洗有機層，合并水層及酸性溶液，加堿后，用無過氧化物乙醚提取，無水硫酸鈉干燥，除去乙醚，測得三苯基磷重量，結(jié)果證明消耗三苯基磷克分子數(shù)與青蒿素相近。1

顯色反應(yīng)

顯色反應(yīng)是用以鑒定青蒿素簡單可行的方法，報道較多，主要有以下幾種：

（1）對二甲氨基苯甲醛縮合反應(yīng)：取實驗產(chǎn)品青蒿素約10 mg，加乙醇2 mL溶解，加對二甲氨基苯甲醛試劑1 mL置水浴上加熱，溶液呈藍紫色反應(yīng)。

（2）異羥肟酸鐵反應(yīng)：取樣同（1），溶于1 mL甲醇中，加入φ=7%鹽酸羥胺甲醇溶液4～5滴，在水浴上加熱至沸，冷卻后加稀鹽酸調(diào)至酸性，再加入φ=1%FeCl3，乙醇溶液1～2滴，溶液呈紫紅色反應(yīng)。

（3）2,4-二硝基苯肼反應(yīng)：取樣同（1），溶于1 mL氯仿后，滴于濾紙片上，以2,4-二硝基肼試液噴灑，在80 ℃烘箱中烘10 min，產(chǎn)生黃色斑點。

（4）堿性間二硝基苯反應(yīng)：取樣同（1），溶于2 mL乙醇中，加入φ=2%間二硝基苯的乙醇液和飽和的KOH乙醇液各數(shù)滴，水浴微熱，溶液呈紅色反應(yīng)。1

氫解反應(yīng)

青蒿素在含有鈀-碳酸鈣的甲醇溶液中，在常溫、常壓下催化氫化，過氧化物被還原成化合物Ⅲ（圖5中的Ⅲ）。在此反應(yīng)過程中，反應(yīng)最初所得為油狀物，若將其溶于有少量丙酮的正己烷中，需放置4～5 d，變?yōu)榛衔铫蟮木w，而在重氮甲烷中則甲酯化得到甲酯化合物Ⅳ（圖5中的Ⅳ）。1

還原反應(yīng)

青蒿素溶于甲醇，在冰浴中（0～5 ℃）攪拌分次慢慢加入固體硼氫化鈉，加完后繼續(xù)攪拌半小時。反應(yīng)液用冰醋酸中和，減壓除去溶媒，即得到化合物Ⅴ（圖5中的Ⅴ）的粗結(jié)晶產(chǎn)物，它是用硼氫化鈉還原青蒿素而得到的半縮醛化合物。如用鈀-碳酸鈣在常溫常壓下進行催化氫化，則會失去氧而得到環(huán)氧化合物。1

與堿反應(yīng)

青蒿素加甲醇溶解，另取碳酸鉀溶于水，將此碳酸鉀溶液在攪拌下緩緩加入青蒿素甲醇溶液，使成均勻混和成澄清液，在20～22 ℃恒溫1 h，加入水，用乙醚提取兩次，醚層用少量水洗2次，水層用φ=10%鹽酸酸化至pH=2，再用乙醚提取3次。乙醚層用水洗至中性，經(jīng)無水硫酸鈉干燥2～3 h，乙醚層減壓抽干，所得殘余物放冰箱過液，有半固體析出，加少許甲醇，冷卻，析出針狀結(jié)晶，即為化合物Ⅵ（圖5中的Ⅵ），過濾再結(jié)晶一次，則得到更精制的結(jié)晶。1

與酸反應(yīng)

青蒿素加入到冰醋酸-濃H2SO4混合液中搖勻，使溶解，25℃放置16～17 h，溶液呈淺棕黃色微帶熒光，將反應(yīng)液倒入等體積冰水中，攪勻，用氯仿提取3次，氯仿層用水沖洗至中性，無水硫酸鈉干燥，減壓除去有機溶劑，得粗結(jié)晶，重結(jié)晶2次，即得化合物Ⅶ（圖5中的Ⅶ）的片狀結(jié)晶，熔點144～146 ℃，[α]10D=-16.2°（c=2.1氯仿）。1

制備方法

化學(xué)合成

1983年，羅氏公司的研究員G.Schmid和W.Hofheinz以薄荷醇為原料首次完成了青蒿素全合成。隨后，上海有機所的周維善等人以香草醛為原料完成了這一全合成。至2003年已有十余種青蒿素全合成路線。這些路線的起始物包括薄荷酮、3-蒈烯和環(huán)己烯酮18192021

青蒿素全合成的逆合成分析

從逆合成分析的角度看，青蒿素的一個特點是它的結(jié)構(gòu)中含有一個1,2,4-三??唑環(huán)。該環(huán)實際上是一個縮酮-縮醛-內(nèi)酯體系的一部分，可以由上圖中α-過氧羥基醛（A）經(jīng)縮合反應(yīng)構(gòu)建。過氧羥基醛（A）又可以由醛（B）的烯醇醚或類似化合物經(jīng)過氧化反應(yīng)獲得。過氧化是青蒿素合成中的關(guān)鍵步驟，盡管不同的路線采用不同的方法引入過氧基團，這步反應(yīng)產(chǎn)率總是比較低。202122

Schmid等人、Ravindranathan等人、Lansbury等人、周維善等人利用烯醇醚在低溫、光照和光敏劑存在下與單線態(tài)的氧分子發(fā)生的[2+2]環(huán)加成反應(yīng)產(chǎn)生四員環(huán)中間體，然后開環(huán)形成過氧化物；Avery等人則利用烯基硅烷的反常臭氧化反應(yīng)引入過氧基團。用酸處理過氧化產(chǎn)物就可以得到青蒿素。2023

1989年，Nancy Acton等人發(fā)現(xiàn)，在低溫和光照下，二氫青蒿酸可以被兩當量的氧氣直接氧化成青蒿素，產(chǎn)率17%-32%。后續(xù)研究表明在反應(yīng)中，二氫青蒿酸先與一分子單線態(tài)氧發(fā)生烯反應(yīng)，生成過氧化物。再與另一分子三線態(tài)氧反應(yīng)，開環(huán)生成α-過氧羥基醛（A），最后脫水產(chǎn)生青蒿素。不久這一反應(yīng)就被用于改進青蒿素的全合成路線。2425但化學(xué)合成青蒿素工藝繁雜，步驟多，成本高，易污染，尤其引入過氧基團的光氧化或化學(xué)氧化的產(chǎn)率不理想，導(dǎo)致化學(xué)全合成工藝一直無法用于青蒿素的商業(yè)化生產(chǎn)。

生物合成

青蒿素存在于中草藥青蒿的花葉中，莖中不含有，是一種含量非常低的萜類化合物，生物合成途徑非常復(fù)雜。

現(xiàn)已知可通過三種方式進行青蒿素的生物合成，一是通過對控制青蒿素合成的關(guān)鍵酶進行調(diào)控，添加生物合成的前體來增加青蒿素的含量；二是激活關(guān)鍵酶控制的基因，大幅度增加青蒿素的含量；三是利用基因工程手段改變關(guān)鍵基因，以增強它們所控制酶的作用效率。

生物合成過程中，青蒿素的含量受光照、外源激素、芽分化等生理生態(tài)因子的影響很大，溫度對于生物合成也有極大影響，通過試驗研究發(fā)現(xiàn)，青蒿幼苗在40℃條件下，處理36h后，青蒿素的質(zhì)量分數(shù)提高到最大為68%。

除青蒿之外，其它植物也可以合成青蒿素，2011年研究人員從煙草中合成青蒿素。此方法與傳統(tǒng)化學(xué)方法相比，所用的化學(xué)試劑大大減少，有利于環(huán)境的保護，且該生物合成方法的受體為煙草，在中國較為廣泛，因此原料來源較為豐富，但不足的是用煙草合成青蒿素過程中的某些反應(yīng)基質(zhì)并不清楚，還有待開發(fā)，但該合成方法仍有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。25

美國科學(xué)家Keasling將一個青蒿基因植入大腸桿菌，改造后的大腸桿菌制造出一種中間化合物，這種化合物經(jīng)過數(shù)步處理就能成為青蒿素的原料——青蒿酸。把一種特殊的酶植入酵母后，酵母把前面提到的中間化合物改造成了青蒿酸。通過微生物工業(yè)生產(chǎn)青蒿素的技術(shù)鏈條已經(jīng)基本成形。如果這一想法得到實現(xiàn)，意味著青蒿素的價格將下降90%。26

2013年4月25日出版的Nature雜志發(fā)表了美國Keasling小組和加拿大Covello小組的兩國科學(xué)家撰寫的研究通信《強效抗瘧劑青蒿素的高水平半合成生產(chǎn)》一文，報道了將酵母工程菌中青蒿素前體青蒿酸的發(fā)酵產(chǎn)量從1.6克/升提高到25克/升，并利用單線態(tài)氧成功地將青蒿酸轉(zhuǎn)化成青蒿素。

提取純化

分離純化工藝主要有溶劑外加能量協(xié)助提取法、提取重結(jié)晶法、超臨界CO2萃取法和溶劑提取層析法。

溶劑提取重結(jié)晶法一般采用的溶劑汽油法，乙醇法和堿水提取酸沉淀法進行生產(chǎn)，此類方法明顯增加了青蒿素植物的有效利用率。

**堿水提取酸沉淀法：**取一定量的青蒿枝葉干粉加入乙醇攪拌浸提，得到乙醇提取液，減壓干燥，將其溶于乙醚-水兩相溶液中，分別得到青蒿素和青蒿酸。此種方法的青蒿酸收率達到90%，青蒿素的提取率為57%。25

**乙醇法：**取一定量的青蒿枝葉干粉，用稀乙醇浸泡24 h，得到乙醇提取液，將其注入連續(xù)萃取裝置，再用含苯和乙酸乙酯的溶劑汽油萃取，得到醇相和萃取相，醇相可循環(huán)使用，萃取相用活性炭脫色，過濾，回收溶劑，然后得到濃溶液，再冷卻結(jié)晶得到青蒿素粗晶物，再用乙醇重結(jié)晶得到青蒿素成品。此方法有收率較高，成本較低，步驟較少，操作簡單，安全等優(yōu)點。25

**溶劑汽油法：**取一定量的青蒿枝葉干粉，用8～10倍120號溶劑汽油浸泡3次，得到溶劑汽油提取液，再減壓濃縮并放置結(jié)晶，得青蒿素粗品，用少量120號溶劑汽油多次洗滌，50%乙醇醇結(jié)晶2～3次，最終得到青蒿素白色針晶。此種方法工藝步驟簡便，容易大批量生產(chǎn)使用。25

溶劑提取層析法有三種提取方法，分別是丙酮-硅膠柱層析法、低沸汽油-超短粗型球狀擴孔硅膠層析法、乙烷提取-乙烷/乙腈-硅膠柱層析法。25

應(yīng)用領(lǐng)域

提到青蒿素，人們首先會想到它的抗瘧疾功用，WHO認為，青蒿素是治療瘧疾耐藥性效果最好的藥物，以青蒿素類藥物為主的聯(lián)合療法，也是當下治療瘧疾的最有效最重要手段。但是近年來隨著研究的深入，青蒿素其它作用也越來越多被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用研究，如抗腫瘤、治療肺動脈高壓、抗糖尿病、胚胎毒性、抗真菌、免疫調(diào)節(jié)等。25

抗瘧疾

瘧疾（俗稱：打擺子寒熱?。儆谙x媒傳染病，是受瘧原蟲感染的按蟲叮咬人體后而引起的一種傳染病，長時間多次發(fā)作后出現(xiàn)可肝脾腫大，且伴隨貧血等癥狀。瘧疾能夠得到一定程度的治療，青蒿素功不可沒。青蒿素結(jié)構(gòu)中過氧鍵具有氧化性，是抗瘧的必需基團。作用機理是青蒿素在體內(nèi)產(chǎn)生的自由基團與瘧原蛋白結(jié)合，改變瘧原蟲的細胞膜結(jié)構(gòu)。自由基團與瘧原蛋白結(jié)合之后會使線粒體的雙層膜脹裂，最終脫落，導(dǎo)致瘧原蟲的細胞結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，同時細胞核內(nèi)的染色質(zhì)也會受到一定的影響。另一方面，氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)，青蒿素作用后。瘧原蟲對異亮氨酸的吸收減少，導(dǎo)致蟲體蛋白的合成受阻。黃花蒿不僅可以殺滅病原蟲，還具有抗血吸蟲作用、治療弓形蟲感染作用、抗卡氏肺孢子蟲作用、抗球蟲作用等。經(jīng)臨床試驗證明，青蒿素及其衍生物在治療瘧疾的過程中，并未發(fā)現(xiàn)特別明顯的副作用。25

抗腫瘤

惡性腫瘤是危害人類健康的第一大殺手，若不及時醫(yī)治則會危害生命安全。體外實驗表明，一定劑量的青蒿素可以使肝癌細胞、乳腺癌細胞、宮頸癌細胞等多種癌細胞的凋亡，明顯抑制癌細胞的生長。研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素可以調(diào)控腫瘤細胞的周期蛋白表達，增強CKIs作用，導(dǎo)致腫瘤細胞周期阻滯；或者導(dǎo)致細胞凋亡，抑制腫瘤血管生成等來抵抗腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。青蒿素對白血病的治療，是通過作用在白血病細胞的細胞膜，增加膜的通透性，改變滲透壓，導(dǎo)致細胞內(nèi)的鈣離子濃度升高，從而能激活鈣蛋白酶，使其細胞膜脹裂，同時加速促使細胞凋亡物質(zhì)的釋放，增加細胞凋亡速度。25

治療肺動脈高壓

肺動脈高壓（PAH）是肺動脈重構(gòu)為特征和以肺動脈壓力升高到一定界限的病理生理狀態(tài)，可以是并發(fā)癥或綜合征。青蒿素用于治療肺動脈高壓：通過舒張血管降低PAH患者的肺動脈壓力，改善癥狀。Zaiman等發(fā)現(xiàn)青蒿素具有抗炎作用，青蒿素及其內(nèi)核物質(zhì)對多種致炎因子有抑制作用，且還可以抑制炎性介質(zhì)產(chǎn)生一氧化氮；青蒿素具有免疫調(diào)節(jié)作用；馮義柏等通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素能夠抑制血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞的增殖，進而在PAH的治療過程中發(fā)揮著重要作用；青蒿素能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，從而抑制肺血管重構(gòu)；青蒿素可以抑制PAH相關(guān)細胞因子的表達，進一步增強青蒿素抗血管重構(gòu)作用。25

免疫調(diào)節(jié)

研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素及其衍生物的使用劑量在不會引起細胞毒性的情況下，能夠較好的抑制T淋巴細胞絲裂原，從而誘導(dǎo)小鼠脾臟淋巴細胞的增殖。這一發(fā)現(xiàn)對于治療T淋巴細胞所介導(dǎo)的自身免疫性疾病，有很好的參考價值。青蒿玻醋具有增強非特異性免疫的作用，能夠使小鼠血清的總補體活性提高。雙氫青蒿素對于B淋巴細胞的增殖，能起到直接的抑制作用，從而減少B淋巴細胞對自身抗體的分泌，減輕體液免疫反應(yīng)，對體液免疫有一定的抑制作用，減少了免疫復(fù)合物的形成。2728

抗真菌

青蒿素的抗真菌作用也使得青蒿素表現(xiàn)出了一定的抗菌活性。研究證實青蒿素的渣粉劑和水煎劑對炭疽桿菌、表皮葡萄球菌、卡他球菌、白喉桿菌均有較強的抑菌作用，對結(jié)核桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌等也具有一定的抑菌作用。2930

抗糖尿病

2016年12月1日，《細胞》雜志上的一項研究表明，青蒿素或許還可以拯救糖尿病患者。來自奧地利科學(xué)院CeMM分子醫(yī)學(xué)研究中心等機構(gòu)的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，青蒿素能夠讓產(chǎn)生胰高血糖素的α細胞“變身”產(chǎn)生胰島素的β細胞。青蒿素結(jié)合了一個稱為gephyrin的蛋白。Gephyrin能夠激活細胞信號的主要開關(guān)—GABA受體。隨后，無數(shù)的生物化學(xué)反應(yīng)發(fā)生變化，導(dǎo)致了胰島素的產(chǎn)生。另一項研究表明，在小鼠模型中，注射GABA也能導(dǎo)致α細胞轉(zhuǎn)化為β細胞，表明兩種物質(zhì)靶向了相同的機制，但青蒿素的長期作用需要進一步測試。31

分布情況

青蒿素主要是從青蒿中直接提取得到的，或提取青蒿中含量較高的青蒿酸，然后半合成得到的。青蒿雖然在世界各地廣泛分布，但青蒿素含量隨產(chǎn)地不同差異極大，具有顯著的生態(tài)顯著性。根據(jù)研究得知，除了中國部分地區(qū)外，世界絕大多數(shù)地區(qū)生產(chǎn)的青蒿中的青蒿素含量都很低，并無利用價值。32

檢測方法

青蒿素檢測的方法包括化學(xué)分析法、光譜分析法、色譜分析法、生物學(xué)方法等。33

|| || 青蒿素毒性實驗數(shù)據(jù)

作用機理

與以往的抗瘧藥物不同，青蒿素抗瘧機理的主要作用是通過對瘧原蟲表膜線粒體等的功能進行干擾，首先作用于食物泡膜、表膜、線粒體，其次作用于核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，對核內(nèi)染色質(zhì)也有一定的影響，最終導(dǎo)致蟲體結(jié)構(gòu)的全部瓦解，而不是借助于干擾瘧原蟲的葉酸代謝。其作用機制也可能主要是干擾表膜—線粒體的功能，作用于食物泡膜，阻斷營養(yǎng)攝取的最早階段，使瘧原蟲較快出現(xiàn)氨基酸饑餓，從而迅速形成自噬泡并不斷排出于蟲體外，瘧原蟲最終損失大量細胞質(zhì)而死亡。35

具體藥理作用分兩步：第一步是活化，青蒿素被瘧原蟲體內(nèi)的鐵催化，其結(jié)構(gòu)中的過氧橋裂解，產(chǎn)生自由基；第二步是烷基化，第一步所產(chǎn)生的自由基與瘧原蟲蛋白發(fā)生絡(luò)合，形成共價鍵，使瘧原蟲蛋白失去功能死亡。青蒿素無論在體內(nèi)和體外的實驗中均對瘧疾有很好的殺滅效果。

青蒿素的作用機制尚不十分清楚，主要是干擾瘧原蟲的表膜-線粒體功能。青蒿素通過影響瘧原蟲紅內(nèi)期的超微結(jié)構(gòu)，使其膜系結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。由于對食物泡膜的作用，阻斷了瘧原蟲的營養(yǎng)攝取，當瘧原蟲損失大量胞漿和營養(yǎng)物質(zhì)，而又得不到補充，因而很快死亡。其作用方式是通過其內(nèi)過氧化物(雙氧)橋，經(jīng)血紅蛋白分解后產(chǎn)生的游離鐵所介導(dǎo)，產(chǎn)生不穩(wěn)定的有機自由基及/或其他親電子的中介物，然后與瘧原蟲的蛋白質(zhì)形成共價加合物，而使瘧原蟲死亡。2015年，Wang等人利用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)手段合成了基于青蒿素結(jié)構(gòu)的化學(xué)探針，準確的鑒定出了青蒿素在瘧原蟲中的100多個蛋白靶點，并且確定了青蒿素的激活依賴于瘧原蟲中生成的大量血紅素。37

自由基的抗瘧作用

青蒿素及其衍生物化學(xué)結(jié)構(gòu)中的過氧橋這一基團是抗瘧作用中最重要的結(jié)構(gòu)。改變過氧基團，青蒿素的抗瘧作用消失。青蒿素在體內(nèi)活化后產(chǎn)生自由基，繼而氧化性自由基與瘧原蟲蛋白質(zhì)中的活性殘基（例如半胱氨酸殘基中的巰基）形成共價鍵，使蛋白失去功能導(dǎo)致瘧原蟲死亡。另一種觀點認為青蒿素轉(zhuǎn)化為碳自由基發(fā)揮烷化作用使瘧原蟲的蛋白烷基化。目前這一觀點被廣泛認可。

對紅內(nèi)期瘧原蟲的直接殺滅作用

青蒿素選擇性殺滅紅內(nèi)期瘧原蟲是通過影響表膜-線粒體的功能，阻斷宿主紅細胞為其提供營養(yǎng)，從而達到抗瘧的目的。同時青蒿素對瘧原蟲配子體具有殺滅作用。

抑制 PfATP6 酶的抗瘧作用

有研究推測青蒿素及其衍生物對 PfATP6（Plasmodium falciparumcalcium ATPase 6）具有強大而特異的抑制效果。PfATP6 是惡性瘧原蟲基因組中唯一一類肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶（sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase，SERCA）。青蒿素抑制 PfATP6，使瘧原蟲胞漿內(nèi)鈣離子濃度升高，引起細胞凋亡，從而發(fā)揮抗瘧作用。

藥典信息

基本信息

本品為(3R,5αS,6R,8αS,9R,12S,12αR)-八氫-3,6,9-三甲基-3,12-氧橋-12H-吡喃并[4,3-j]-1,2-苯并二氧雜環(huán)庚熳-10(3H)-酮，按干燥品計算，含C15H22O5應(yīng)為98.0%~102.0%。

性狀

本品為無色或白色針狀結(jié)晶。

本品在丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷中易溶，在甲醇、乙醇、稀乙醇、乙醚及石油醚中溶解，在水中幾乎不溶，在冰醋酸中易溶。

熔點

本品的熔點（通則0612第一法）為150~153 ℃。

比旋度

取本品，精密稱定，加無水乙醇溶解并定量稀釋制成每1 mL中含10 mg的溶液，依法測定（通則0621），比旋度為+75°至+78°。

鑒別

1、取本品約5 mg，加無水乙醇0.5 mL溶解后，加碘化鉀試液0.4 mL，稀硫酸2.5 mL與淀粉指示液4滴，立即顯紫色。

2、取本品約5 mg，加無水乙醇0.5 mL溶解后，加鹽酸羥胺試液0.5 mL與氫氧化鈉試液0.25 mL，置水浴中微沸，放冷后，加鹽酸2滴和三氯化鐵試液1滴，立即顯深紫紅色。

3、照薄層色譜法（通則0502）試驗。

供試品溶液：取本品適量，加二氯甲烷溶解并稀釋制成每1mL中約含3mg的溶液。

對照品溶液：取青嵩素對照品適量，加二氯甲烷溶解并稀釋制成每1mL中約含3mg的溶液。

色譜條件：采用硅膠G薄層板，以石油醚（60~90℃）-乙醚（1:1）為展開劑。

測定法：吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一薄層板上，展開，晾干，噴以茴香醛甲醇溶液（取冰醋酸10 mL與濃硫酸5 mL，緩緩加到55 mL甲醇中，放冷，將此溶液加入含有0.5 mL茴香醛的30 mL甲醇中，搖勻，避光保存），在110 ℃，加熱3~5分鐘使顯色。

結(jié)果判斷：供試品溶液所顯主斑點的顏色和位置應(yīng)與對照品