定義
柱狀假絲酵母(C. cylindracea),是一種半子囊不產(chǎn)孢子的假絲狀單細(xì)胞非致病酵母真菌。該酵母通常被認(rèn)為是對(duì)人類(lèi)和其它生命形式都是安全的。其所產(chǎn)的脂肪酶(C. rugosa lipase , CRL)廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)與現(xiàn)代工業(yè),如脂肪酸的生產(chǎn)、各種酯類(lèi)的合成等,是當(dāng)前世界上應(yīng)用最廣泛的商品化脂肪酶之一。
另外,在巧克力的生產(chǎn)過(guò)程中,柱狀假絲酵母起到了很大的作用??煽蓸?shù)的種子內(nèi)含有大量的糖,非常適合柱狀假絲酵母的生長(zhǎng)。它能將種子內(nèi)的這些糖轉(zhuǎn)化為乙醇,并分解果膠質(zhì)。如果沒(méi)有柱狀假絲酵母的參與,最終的產(chǎn)品是非??酀?。最終,柱狀假絲酵母會(huì)由于高濃度的醇而死亡,可可豆經(jīng)過(guò)一些后續(xù)化處理如干燥,包裝得到最終的產(chǎn)品。1
柱狀假絲酵母脂肪酶大多數(shù)微生物脂肪酶分子量在 30-40 kDa 之間,而 C. rugosa 脂肪酶(CRL)和Geotrichum candidum 脂肪酶(GCL)分子量較大,約 60 kDa。CRLs 和 GCLs 是一類(lèi)與膽堿酯酶(cholinesterase)結(jié)構(gòu)類(lèi)似的脂肪酶,都具有 α/β 水解酶的折疊結(jié)構(gòu)和Ser-His-Glu 三聯(lián)體催化中心。隨著脂肪酶的純化及 基因克隆與表達(dá)研究的深入,發(fā)現(xiàn)兩種屬脂肪酶均存在基因多態(tài)性現(xiàn)象,在 C. rugosa 中發(fā)現(xiàn)至少有 7 種脂肪酶同工酶,G. candidum 為 2 種,這些同工酶在一級(jí)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)上都存在差異。工業(yè)上廣泛用作催化劑的 GCL 和 CRL 大多是混有幾種同工酶的粗酶。1
柱狀假絲酵母脂肪酶研究進(jìn)展1990 年,有研究首次報(bào)道了 C. rugosa lip1 的突變體核酸序列,到目前為止,先后從 C. rugosa 克隆出 8 個(gè)脂肪酶基因,研究者通過(guò) Southern 雜交從 C. rugosa 基因組文庫(kù)中分別得到 lip1~lip5 全長(zhǎng)核酸序列,并預(yù)測(cè) lip6 和 lip7 基因。其中 lip1、lip3、lip4 和 lip5 基因序列全長(zhǎng)為 1650 bp,lip2 基因序列全長(zhǎng)為 1647 bp。研究發(fā)現(xiàn)這些同工酶的基因均不含內(nèi)含子,基因定位在 C. rugosa 的 I 號(hào)染色體上,成熟的脂肪酶包含 534 個(gè)氨基酸,分子量約為 60 kDa,等電點(diǎn)在 4.5~6.0 之間,具有不同的糖基化程度和底物特異性,但是基因的同源性高達(dá) 70%。隨后 Xu 等從 C.rugosa (ATCC14830) 菌株中克隆得到 lipJ08 基因,全長(zhǎng) 1650 bp,編碼 549 個(gè)氨基酸,其中包含一個(gè) 15 個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽,成熟的脂肪酶包含 534 個(gè)氨基酸,與該菌株同工酶的一級(jí)序列比對(duì),同源性高達(dá) 89%。研究發(fā)現(xiàn) C. rugosa 不遵循常用的密碼子系統(tǒng),通常編碼亮氨酸的密碼子 CTG,在 C. rugosa 中編碼絲氨酸 (Ser) ,包括在 CRL各組分中的催化位點(diǎn) Ser209 也是由 CTG 編碼。因此,C. rugosa 脂肪酶基因直接異源表達(dá),得到的是無(wú)活性的蛋白。為解決這個(gè)問(wèn)題,可以選擇密碼子使用模式相同的微生物作為宿主菌株或者將非常規(guī)密碼子 CTG 改為 TCT 再進(jìn)行異源表達(dá)。Brocca等首次用全基因合成方法將密碼子 CTG 突變?yōu)?TCN,其中包括催化位點(diǎn)Ser209,合成了的 lip1 基因,并在 Saccharomyces cerevisiae 和 Pichia pastoris 中異源表達(dá),都得到有活性的蛋白,且轉(zhuǎn)入 P. pastoris 的轉(zhuǎn)化子在 1-L 搖瓶中 pH 6.0 條件下,發(fā)酵 280 h 酶活達(dá)到 150 U/mL,且對(duì) C8 和 C10 長(zhǎng)度的脂類(lèi)顯示較高的水解活力。
隨后 Tang 等采用重疊延伸 PCR 技術(shù)將 lip4 基因中 19 個(gè)編碼絲氨酸的密碼子 CTG 進(jìn)行改造,分別在大腸桿菌和畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)。lip4 有唯一一個(gè)柱狀假絲酵母脂肪酶糖基化位點(diǎn) Asn-351,在畢赤酵母中表達(dá)的重組酶經(jīng)過(guò)糖基化后,熱穩(wěn)定從 52 °C 升至 58 °C,但是催化性質(zhì)與大腸桿菌中表達(dá)的產(chǎn)物沒(méi)有明顯差異。對(duì)兩種重組脂肪酶活性測(cè)定,發(fā)現(xiàn)對(duì)長(zhǎng)鏈酯(C16 和 C18)有較高的酯活力,對(duì)不飽和的長(zhǎng)鏈脂肪也有較高的活性。
2002 年,Lee 等克隆 C.rugosa 的脂肪酶 lip2 基因利用 Overlap extension PCR技術(shù)將該基因中的 17 個(gè)編碼絲氨酸的 CTG 密碼子突變?yōu)?TCT,在 P. pastorisSMD168H 成功表達(dá)。該酶最適 pH 為 7.0,在最適溫度為 30~50 °C,對(duì) C12~C16 的對(duì)硝基苯酯有較高的水解活力,轉(zhuǎn)酯和醇酯化效果最佳的底物分別是丁酸和 C18。同時(shí),對(duì)三丁酸甘油脂和十二酸膽固醇酯活性最高。Ferrer 等將 lip2 用 AOX 作為啟動(dòng)子在畢赤酵母中異源表達(dá),重組酶 LIP2 的表達(dá)量比原始 C.rugosa 菌株發(fā)酵 LIP2產(chǎn)量提高了 10 倍。
2005 年,Chang 等人應(yīng)用 RT-PCR 技術(shù)從 C.rugosa(X64703)菌株基因組中克隆 lip1 基因,利用 Overlap extension PCR 技術(shù)將該基因的成熟肽 19 個(gè)編碼絲氨酸的CTG 密碼子突變?yōu)?TCT,以 P. pastoris KM71 作為宿主菌株,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后,以三丁酸甘油酯為底物,酶活力為 253.3 U/mL。
2006 年,Chang 等將 lip3 中 18 個(gè)編碼絲氨酸的 CTG 密碼子用重疊延伸 PCR技術(shù)定點(diǎn)突變?yōu)?TCT;同時(shí)將 5’端 339 個(gè)堿基進(jìn)行密碼子優(yōu)化,改造后的兩段基因在畢赤酵母中表達(dá)出有活性的蛋白,密碼子優(yōu)化后表達(dá)的重組酶活力比未優(yōu)化的提高 1.44 倍。重組脂肪酶的最適溫度范圍為 20~50 °C,最適 pH 4.0~6.0,對(duì) C8~C12的 pNP 酯有較高的水解活力。
2011 年,Lee 等將 lip5 基因的 16 個(gè)編碼絲氨酸的 CTG 密碼子定點(diǎn)突變,在畢赤酵母中表達(dá)。重組 LIP5 在最適反應(yīng)溫度為 50 °C,最適 pH 為 8.0。研究底物特異性發(fā)現(xiàn),重組酶對(duì)短鏈 pNP 酯(C4)、丁酰輔酶 A (C4)有較高的水解活性, LIP5與 LIP4 和 LIP2 都對(duì)短鏈底物有較好的水解作用。2
柱狀假絲酵母脂肪酶應(yīng)用柱狀假絲酵母脂肪酶可以催化水解、醇解、轉(zhuǎn)酯和酯化等多種反應(yīng),根據(jù)該酶的不同特性應(yīng)用于工業(yè)的不同領(lǐng)域。CRLs 對(duì)甘油三酯中的 Sn-2 和 Sn-1/3 位酯鍵的識(shí)別和水解具有不同選擇特異性且對(duì)底物的立體對(duì)映結(jié)構(gòu) 1 位和 3 位酯鍵的表現(xiàn)出較高的識(shí)別特異性和對(duì)映選擇性,因此,常用于制備對(duì)映體有機(jī)化合物,藥物手性拆分,外消旋醇和酯的動(dòng)力學(xué)拆分和催化合成大量藥品,例如催化合成有光學(xué)活性的非甾醇類(lèi)抗炎藥(苯酮苯丙酸、萘普生、布洛芬),生物堿類(lèi)的光學(xué)異構(gòu)體合成、抗生素、二級(jí)醇、生化抑制劑和前藥等。Chen 等固定化 C. rugosa 脂肪酶后在環(huán)己烷中合成了(S)-布洛芬酯。利用 C. rugosa 脂肪酶對(duì)長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸催化活性低這一特性,可以從魚(yú)油中生產(chǎn) EPA 和 DHA。除此以外,柱狀假絲酵母脂肪酶還被廣泛應(yīng)用于生物傳感器、生物材料、生物降解和生物識(shí)別等領(lǐng)域中。1