[科普中國]-蜂蜜酵母

蜂蜜酵母的篩選

酵母菌分離純化取自然發(fā)酵的蜂蜜發(fā)酵液1mL，梯度稀釋至10-7。選擇10^-3～10^-4稀釋度，取稀釋的50μL菌液涂布于麥芽汁培養(yǎng)基和沙氏培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48h，待長出菌落，挑選整齊的單個菌落，將單菌落劃線分離2～3次，直至菌落形態(tài)和菌體形態(tài)基本一致，經(jīng)顯微鏡檢驗為純種后轉(zhuǎn)于麥芽汁瓊脂斜面，4℃保存。菌種用阿拉伯?dāng)?shù)字S1，S2，S3，S4…依次編號。

酵母菌的初篩取10mL糖度為10°Brix的麥芽汁液體培養(yǎng)基，滅菌，冷卻后接種8%酵母菌，比較酵母菌在杜氏管中的產(chǎn)氣情況，篩選產(chǎn)氣量大，起酵時間在48h內(nèi)的酵母菌株。記錄發(fā)酵時間和產(chǎn)氣情況，重復(fù)3次。活化條件：10°Brix麥芽汁液體培養(yǎng)基28℃震蕩10h，接種量8%；發(fā)酵條件：13°Brix麥芽汁28℃靜止發(fā)酵48h。

酵母菌的復(fù)篩高滲耐受性

采用杜氏發(fā)酵管法測定酵母菌耐高滲能力。將分離菌接種到40%烏桕蜜試管中，28℃培養(yǎng)24h。在660nm處測定OD值。試管連續(xù)培養(yǎng)，觀察泡沫產(chǎn)生情況。根據(jù)氣體產(chǎn)生的速度和產(chǎn)氣量，比較不同酵母菌株的耐高滲能力。

酒精耐受性

從實際生產(chǎn)而言，要想采用直接發(fā)酵法生產(chǎn)出酒精度較高，品味良好的蜂蜜酒，一般要將酵母菌直接置于25%～30%的蜜汁中培養(yǎng)。酵母發(fā)酵能力在很大程度上取決于它對酒精耐受力的大小。采用30%蜂蜜、20%酒精環(huán)境下篩選酵母菌。取已滅菌的試管數(shù)支，以無菌操作將酵母菌接入體積分數(shù)為20%乙醇和無菌麥芽汁培養(yǎng)基中，搖勻，28℃培養(yǎng)7d，然后在660nm處測OD值，同時觀察氣泡產(chǎn)生的情況。

pH耐受性

耐酸酵母是指在pH≤4的環(huán)境下，可以生長或代謝的酵母。采用pH4.0的環(huán)境培育篩選酵母菌。將分離菌接種到pH4.0的麥芽汁液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，在660nm處測OD值，觀察氣泡產(chǎn)生情況。

SO2耐受性

采用添加200mg/LNaHSO3的方法，比較OD值和產(chǎn)氣時間。將酵母菌接入含200mg/LNaHSO3的麥芽汁培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)，于660nm處測OD值。同時觀察杜氏管中的氣泡產(chǎn)生情況（產(chǎn)氣時間和產(chǎn)氣量），篩選所需釀造菌株1。

蜂蜜酵母活性測定發(fā)酵性能的測定將蜜起始糖度調(diào)整為25%，75℃滅菌30min，冷到28℃左右，加入0.15%阿米諾酶，分別接入5種活化的優(yōu)良菌種（S2、S11、S21、S33、S37）和0.2%葡萄酒活性干酵母（CK），28℃，發(fā)酵7d，測定蜂蜜酒的酒精度、殘?zhí)?、酸度和總酯等理化指?biāo)。

酒精度的測定：密度瓶法；pH值的測定：采用pH計法；總糖的測定：手持測糖儀；酸度的測定：滴定中和法；總酯的測定：蒸餾皂化法。

酵母菌發(fā)酵力測試采用CO2失重法，將活化好的優(yōu)選酵母菌液和CK菌液接入已滅菌的麥芽汁培養(yǎng)基中，接種完畢，稱重發(fā)酵瓶，28℃培養(yǎng)，連續(xù)發(fā)酵12d，然后每天稱重1次。稱重前先搖晃瓶子，除去二氧化碳。以產(chǎn)生CO2的量（發(fā)酵瓶失重）為縱坐標(biāo)，發(fā)酵時間為橫坐標(biāo)，繪制發(fā)酵速率曲線。

凝聚性測定將活化好的菌株和CK分別接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)5d。取培養(yǎng)液置離心管中，3500r/min離心15min，收集酵母細胞。用無菌水洗滌2～3次，取酵母泥1g，放入15mL離心管中，加入10mLpH4.5的醋酸緩沖溶液，搖勻，使其成懸浮狀態(tài)，20℃水浴中靜置20min。將此懸浮液連續(xù)搖動5min，讓酵母重新懸浮，再靜置，記錄10min時沉淀酵母的容積，即酵母細胞沉淀的體積，本斯值。凝聚性強弱依據(jù)本斯值來確定。

蜂蜜酒酵母菌的分子生物學(xué)鑒定為進一步確定優(yōu)良酵母的種屬地位，從酵母菌初篩、復(fù)篩的實驗結(jié)果中挑選1株代謝旺盛的供試酵母菌，用無菌水洗滌。用酵母基因組DNA試劑盒提取酵母的DNA。以擴增酵母菌26SrD-NA序列的通用引物設(shè)計PCR擴增引物，上游引物5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，下游引物5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’。

PCR反應(yīng)體系25μL，其中10×PCRBuffer2.5μL，dNTP2.0μL，10μmol/L上、下游引物各0.5μL，酵母基因組DNA1.0μL，TagDNA聚合酶0.5μL，其余為ddH2O。反應(yīng)條件：94℃變性3min；94℃變性50s，55℃復(fù)性50s，72℃延伸1.5min，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物與PGEMeasy-T載體連接，陽性克隆經(jīng)酶切鑒定后測序。所得序列用Blast軟件與GeneBank中的其它酵母菌26SrDNA序列進行比對，找出與其相似性最高的序列及酵母菌種類，用MEGA4.0軟件采用鄰近法（Neighbor-Jointing）進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建與分析2。