[科普中國]-PH值增值法

滴定法和pH增值法

滴定法是國家標(biāo)準(zhǔn)方法(標(biāo)準(zhǔn)編號GB/T1356787—1997)，具有仲裁性。但是由于滴定法要求精度高，所用試劑品種較多，且配制復(fù)雜，測定過程中操作時(shí)間較長，操作步驟較嚴(yán)格，給檢測人員的批次測定帶來不便，難以迅速地指導(dǎo)生產(chǎn)。所以在實(shí)際生產(chǎn)中，一般多用pH增值法測定酶活性。pH增值法由于測定結(jié)果的準(zhǔn)確度和精確度都不高，因此，不具有仲裁性。

雖然用滴定法和pH增值法測得的酶活性的數(shù)據(jù)有較大差別，不能直接通用，但是可以根據(jù)它們之間的聯(lián)系，建立一定條件，找到一種簡便易行的方法進(jìn)行數(shù)值間的相互代換，從而實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)過程的以簡代繁，以達(dá)到迅速、高效地指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)的目的。

脲酶活性的定量測定—pH增值法1、測定原理

大豆餅粕與中性尿素緩沖液混合，在30℃恒溫條件下，脲酶催化尿素水解產(chǎn)生氨使溶液pH值升高。試樣反應(yīng)30min后，與空白溶液的pH值之差可間接表示氨量的多少，從而反映脲酶活性的高低。

2、試劑與溶液

①磷酸緩沖液：0.05mol/L。稱取3.403g磷酸二氫鉀(KH2PO4)，溶于100ml水中。再稱取4.355g磷酸氫二鉀(K2HPO4)溶于100ml水中，合并上述2種溶液并稀釋至1 000ml。使用前應(yīng)用酸溶液或堿溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0。緩沖液保存期90d。

②尿素緩沖液：稱取15g尿素，溶于500ml磷酸緩沖液中，調(diào)節(jié)溶液pH值為7.0。為防止細(xì)菌滋生，可加入5ml甲苯。

3、儀器設(shè)備

①酸度計(jì)：具有玻璃電極、甘汞電極；精度0.02pH值。

②恒溫水?。嚎煽刂茰囟?30±0.5)℃。

③具塞刻度試管：直徑18mm，長150mm。

④粉碎機(jī)：粉碎時(shí)應(yīng)不生強(qiáng)熱(如球磨機(jī))。

⑤樣品篩：孔徑400μm。

⑥分析天平：感量0.0001g。

4、測定步驟

①準(zhǔn)確稱取(0.200±0.001)g樣品于試管(A管)中，加入20ml中性尿素緩沖液，立即加塞混勻，30℃恒溫水浴中準(zhǔn)確保持30min。在混合操作時(shí)切勿倒置試管。

②空白試驗(yàn)須準(zhǔn)確稱取(0.200±0.001)g樣品于試管(B管)中，加入20ml磷酸緩沖液，立即加塞混勻，30℃恒溫水浴中準(zhǔn)確保持30min。在混合操作時(shí)切勿倒置試管。

上述試驗(yàn)的制備和空白試驗(yàn)的制備須相隔5min，水浴期間每5min搖勻試管內(nèi)容物一次。

③30min后，依次從水浴中取出試管，將上層液體移入小燒杯中，在水浴中取出剛達(dá)5min時(shí)，分別測定溶液的pH值。

5、結(jié)果計(jì)算

試驗(yàn)溶液pH值與空白溶液pH值之差即為尿素酶活性的指數(shù)。

尿素酶活性=A-B

式中：A—A管的pH值；

B—B管的pH值。

6、注意事項(xiàng)

①應(yīng)提早一天浸泡電極，保持電極清潔。

②有時(shí)樣品中的可溶物會附著在電極上，使電解質(zhì)經(jīng)過甘汞電極的多孔纖維流動速度降低，因此測定溶液的pH值時(shí)應(yīng)快速1。